本发明公开了一种获自盐碱湖微生物的抗逆相关蛋白IMSAL1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。(c)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物发育相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明提供的IMSAL1蛋白及其编码基因可用于作物抗逆基因工程，对于培育耐逆植株，特别是耐盐胁迫和耐氧化胁迫的植株具有重大价值。
1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)-6)中任一所述的DNA分子：1)序列表中序列3自5’末端第187至744位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列3自5’末端第187至747位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)序列表中序列2自5’末端第187至744位核苷酸所示的DNA分子；5)序列表中序列2自5’末端第187至747位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。
5.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。
8.一种获得转基因生物的方法，包括如下步骤：为将权利要求2或3所述基因导入出发生物中，得到耐逆性增加和/或发育增快的转基因生物；所述生物为烟草；所述耐逆性为耐盐胁迫和/或耐氧化胁迫；所述发育增快体现为生长周期缩短。
9.一种获得转基因生物的方法，包括如下步骤：为将权利要求2或3所述基因导入出发生物中，得到耐逆性增加的转基因生物；所述生物为大肠杆菌；所述耐逆性可为耐盐胁迫和/或耐碱胁迫。
10.权利要求1所述蛋白作为Na⁺/H⁺转运蛋白的应用。技术领域
本发明涉及一种获自盐碱湖微生物的抗逆相关蛋白IMSAL1及其编码基因和应用。
背景技术
环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。生物对自然环境中逆境胁迫的适应是一个复杂的过程，依赖于一系列分子网络的级联激活，即：逆境胁迫的感应、感应信号的传导、特定的与胁迫有关的基因的表达及代谢产物的合成，进而达到细胞内离子平衡的重新建立以及相关蛋白和膜系统的结构及功能的保护和恢复，最后使生物获得对盐胁迫的耐受或抵抗。因此，可以利用这些基因，通过基因工程手段，提高生物对胁迫的耐受性。极端环境微生物中蕴藏着极其丰富的基因资源，从中发掘潜在抗逆相关基因，将其导入植物，探索这些基因在提高植物的耐逆性中的可用性，这方面的研究在理论上可以了解植物和微生物抗逆机理的异同，在应用上可望获得能用于重要农作物性状改良的特有基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种获自盐碱湖微生物的抗逆相关蛋白IMSAL1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，来自盐碱湖微生物，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。(c)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物发育相关的由(a)衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列xa0xa0标签
xa0xa0残基
xa0xa0序列
xa0xa0Poly-Arg
xa0xa05-6(通常为5个)
xa0xa0RRRRR
xa0xa0Poly-His
xa0xa02-10(通常为6个)
xa0xa0HHHHHH
xa0xa0FLAG
xa0xa08
xa0xa0DYKDDDDK
xa0xa0Strep-tagxa0II
xa0xa08
xa0xa0WSHPQFEK
xa0xa0c-myc
xa0xa010
xa0xa0EQKLIxa0SEEDL
上述(b)和(c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)和(c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为如下1)-8)中任一所述的DNA分子：1)序列表中序列3自5’末端第187至744位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列3自5’末端第187至747位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)序列表中序列2自5’末端第187至744位核苷酸所示的DNA分子；5)序列表中序列2自5’末端第187至747位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列2所示的DNA分子；7)在严格条件下与1)至6)中任一所述的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；8)与1)至6)中任一所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选。所述重组表达载体具体可为如下(I)或(II)：(I)在载体pPZP-GFP的多克隆位点间插入所述基因得到的重组质粒；(II)在载体pUC19的多克隆位点间插入所述基因得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将(II)所述重组质粒导入大肠杆菌中得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DH10B。本发明还保护一种获得转基因生物的方法，包括如下步骤：将所述基因导入出发生物中，得到耐逆性增强和/或发育增快的转基因生物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的生物中。携带有所述基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化所述生物的细胞或组织。所述生物为植物时，所述基因可通过(I)所述重组表达载体导入所述出发生物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为烟草，如Nicotianaxa0tabacumxa0L.(cv.xa0Petitxa0havanaxa0SR1)。所述耐逆性可为耐盐胁迫和/或耐碱胁迫和/或耐氧化胁迫。所述发育增快具体可以体现为生长周期缩短(如开花时间提前)。所述生物为微生物时，所述基因可通过(II)所述重组表达载体导入所述出发生物。所述微生物可为大肠杆菌，如大肠杆菌DH10B。所述耐逆性可为耐盐胁迫和/或耐碱胁迫和/或耐氧化胁迫。本发明还保护所述蛋白作为Na⁺/H⁺转运蛋白的应用。本发明提供的IMSAL1蛋白及其编码基因可用于作物抗逆基因工程，对于培育耐逆植株，特别是耐盐胁迫和耐氧化胁迫的植株具有重大价值。备注：本发明由农业部“转基因生物新品种培育重大专项”(课题编号：2009ZX08009-096B)资助。
附图说明
图1为实施例3中大肠杆菌生长曲线测定的结果。图2为实施例4中大肠杆菌生长曲线测定的结果。图3为实施例5中盐胁迫前后的烟草照片。图4为实施例5中盐胁迫后烟草中的叶绿素含量。图5和图6为实施例5中烟草受氧化胁迫后的照片。图7为实施例5中萌发65天后烟草的照片。图8为转基因烟草中几个离子通道蛋白基因表达量的变化.图9为转基因烟草中乙烯合成相关基因表达量变化。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。甲基紫晶(MV)：sigma-a]drich，货号856177。载体pUC19：Promega，货号VKP0279。实施例中所用的烟草均为Nicotianaxa0tabacumxa0L.(cv.xa0Petitxa0havanaxa0SR1)；公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：Ivanaxa0T.，ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="390"/>M.L.，ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="150"/>V.B.，ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="302"/>(2007)xa0Ultrasonicxa0xa0extractionxa0xa0ofxa0xa0oilxa0fromtobacco(Nicotianaxa0tabacumL.)seeds.Ultrasonicsxa0Sonochemistryxa014(5)：646-652。载体pPZP-GFP：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：马银平，沈法富，夏桂先，王付欣，杨淳淋(2012).海岛棉几丁质酶基因GbCHI的克隆与功能分析.遗传，V34(2)。大肠杆菌DH10B：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：WUxa0Wu-Wei，WANGxa0Jing-Wen，XIExa0Fei，LONGxa0Qing-Xin，WANGxa0Xun-Zhang(2003)xa0Baculovirusxa0p74Genexa0isxa0axa0Species-specificxa0Gene.Actaxa0Biochimicaxa0etxa0Biophysicaxa0Sinica，35(9)：864-872。大肠杆菌缺失体Knabc(敲除三个Na⁺/H⁺转运蛋白基因的大肠杆菌)：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：杨礼富，张博，王磊，杨苏声(2008).Na+/H+逆向转运蛋白NhaH短的C末端亲水域介导盐抗性和pH感应.科学通报19：2313-2317。实施例1、盐碱湖微生物耐逆相关蛋白IMSAL1及其编码基因的发现利用盐碱湖环境基因组文库，在含500mMxa0NaCl的LB平板上筛选出一个耐盐菌落，DNA序列分析结果表明该菌落所含DNA插入片段长度为907bp，如序列表的序列2所示，其中包含一个长度为558bp的开放读码框(ORF)，编码186个氨基酸。将序列1所示的蛋白质命名为IMSAL1蛋白，由186个氨基酸残基组成。将编码IMSAL1蛋白的基因命名为IMSAL1基因。野生型IMSAL1基因的开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第187至744位核苷酸所示。在序列2所示IMSAL1基因的基础上进行密码子优化，得到序列表的序列3所示基因。为了与序列2区分，将序列3所示基因命名为UIMSAL1基因。UIMSAL1基因更易于在烟草中被识别和表达，方便在模式植物烟草中对该基因的功能进行研究。实施例2、重组质粒的获得一、基因的克隆1、IMSAL1基因的克隆(1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子(IMSAL1基因)。(2)以步骤1的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。F1：5’-TGCxa0TCTxa0AGAxa0ATGxa0GGTxa0GGCxa0TATxa0ACAxa0GGTxa0TATxa0TTC-3’(下划线标注XbaI酶切识别位点)；R1：5’-CGxa0GAGxa0CTCxa0CTAxa0ATGxa0GATxa0ATGxa0ATTxa0TATxa0TTGxa0AGGxa0C-3’(下划线标注SacI酶切识别位点)。F1和R1的靶序列为序列表中序列2自5’末端第187至744位核苷酸。PCR扩增体系(50μl)：模板1μl，10×bufferxa05μl，dNTP(10mM)xa01μl，F1xa01μl，R1xa01μl，Pfuxa0DNAxa0Polymerase(TaKaRa)xa01μl，ddH₂Oxa040μl。PCR扩增条件：94℃xa03min；94℃xa030s、54℃xa030s、72℃xa030s，30个循环；72℃xa010min。2、UIMSAL1基因的克隆(1)合成序列表的序列3所示的双链DNA分子(UIMSAL1基因)。(2)以步骤1的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。F2：5’-AAAxa0GGATCCxa0ATGxa0GGCxa0GGGxa0TACxa0ACA-3’(下划线标注BamHxa0I酶切识别位点)；R2：5’-CGxa0GAGxa0CTCxa0TCAxa0GTGxa0TATxa0ATGxa0ATTxa0GA-3’(下划线标注Sacxa0I酶切识别位点)。F2和R2的靶序列为序列表中序列3自5’末端第187至744位核苷酸。PCR扩增体系(50μl)：模板1μl，10×bufferxa05μl，dNTP(10mM)xa01μl，F2xa01μl，R2xa01μl，Pfuxa0DNAxa0Polymerasexa0(TaKaRa)xa01μl，ddH₂Oxa040μl。PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s、54℃30s、72℃30s，30个循环；72℃xa010min。3、IMSAL1基因的克隆(1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子(IMSAL1基因)。(2)以步骤1的双链DNA分子为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。F3：5’-CGCxa0GTCxa0GACxa0ATGxa0GGTxa0GGCxa0TATxa0ACAxa0GGTxa0TATxa0TTCxa0G-3’(下划线标注Salxa0I酶切识别位点)；R3：5’-CGxa0GGAxa0TCCxa0Cxa0TAAxa0TGGxa0ATAxa0TGAxa0TTTxa0ATTxa0TGAxa0GGC-3’(下划线标注BamHxa0I酶切识别位点)。F3和R3的靶序列为序列表中序列2自5’末端第187至744位核苷酸。PCR扩增体系(50μl)：模板1μl，10×bufferxa05μl，dNTP(10mM)xa01μl，F1xa01μl，R1xa01μl，Pfuxa0DNAxa0Polymerasexa0(TaKaRa)xa01μl，ddH₂Oxa040μl。PCR扩增条件：94℃xa03min；94℃xa030s、54℃xa030s、72℃xa030s，30个循环；72℃xa010mixa0n。二、重组质粒的构建1、用限制性内切酶Xbaxa0I和Sacxa0I双酶切步骤一的1克隆的IMSAL1基因，得到酶切产物。2、用限制性内切酶Xbaxa0I和Sacxa0I双酶切载体pPZP-GFP，回收载体骨架(约10kb)。3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pPZP-IMSAL1。根据测序结果，对重组质粒pPZP-IMSAL1进行结构描述如下：在载体pPZP-GFP的XbaI和Sacxa0I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第187至744位核苷酸所示的DNA片段。4、用限制性内切酶BamHxa0I和Salxa0I双酶切步骤一的3克隆的IMSAL1基因，得到酶切产物。5、用限制性内切酶BamHxa0I和Salxa0I双酶切载体pUC19，回收载体骨架(约2600bp)。6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pUC19-IMSAL1。根据测序结果，对重组质粒pUC19-IMSAL1进行结构描述如下：在载体pUC19的BamHxa0I和Salxa0I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第187至744位核苷酸所示的DNA片段。7、用限制性内切酶BamHxa0I和Sacxa0I双酶切步骤一的2克隆的UIMSAL1基因，得到酶切产物。8、用限制性内切酶BamHxa0I和Sacxa0I双酶切载体pPZP-GFP，回收载体骨架(约10kb)。9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到重组质粒pPZP-UIMSAL1。根据测序结果，对重组质粒pPZP-UIMSAL1进行结构描述如下：在载体pPZP-GFP的BamHI和Sacxa0I酶切位点之间插入了序列表的序列3自5’末端第187至744位核苷酸所示的DNA片段。实施例3、重组大肠杆菌的获得及其耐盐性测定一、重组大肠杆菌和对照大肠杆菌的获得1、将实施例2构建的重组质粒pUC19-IMSAL1电击法转入到大肠杆菌DH10B，获得重组大肠杆菌。2、将载体pUC19电击法转入到大肠杆菌DH10B，获得对照大肠杆菌。二、大肠杆菌的耐盐性测定将重组大肠杆菌、对照大肠杆菌和大肠杆菌DH10B分别进行如下实验：1、将大肠杆菌单菌落接种到5mlxa0LB培养基中37℃培养过夜，用LB培养液稀释至OD₆₀₀＝1，即为大肠杆菌菌液。2、取5ml大肠杆菌菌液接种于200ml新鲜的LB培养液中，37℃、180rpm振荡培养，每隔1小时测一次600nm处的吸光值，绘制生长曲线。结果见图1A。3、取5ml大肠杆菌菌液接种于200ml含6g/100mLxa0NaCl的新鲜的LB培养液中，37℃培养，每隔1小时测一次600nm处的吸光值，绘制生长曲线。结果见图1B。大肠杆菌DH10B与对照大肠杆菌的生长曲线一致。重组大肠杆菌的生长曲线位于对照大肠杆菌的生长曲线以上，即含菌量较高。结果表明，导入IMSAL1基因的重组大肠杆菌的耐盐性显著高于对照大肠杆菌和大肠杆菌DH10B。实施例4、IMSAL1的功能验证-Na⁺/H⁺转运蛋白功能一、重组大肠杆菌和对照大肠杆菌的获得1、将实施例2构建的重组质粒pUC19-IMSAL1电击法转入到大肠杆菌缺失体Knabc，获得重组大肠杆菌。2、将载体pUC19电击法转入到大肠杆菌缺失体Knabc，获得对照大肠杆菌。二、IMSAL1的功能验证将重组大肠杆菌、对照大肠杆菌、大肠杆菌K12(指示菌)和大肠杆菌缺失体Knabc分别进行如下实验：1、将大肠杆菌单菌落接种到5mlxa0LB培养基中37℃培养过夜，用LB培养液稀释至OD₆₀₀＝1，即为大肠杆菌菌液。2、耐碱性检测取5ml大肠杆菌菌液接种于不同的培养基中，37℃振荡培养12小时，测定600nm处的吸光值。分别采用以下几种培养基：培养基1：在液体LB培养基中加入缓冲试剂caps、缓冲试剂ches和缓冲试剂tricane(使三种缓冲试剂的浓度均为50mM)，再用10Mxa0NaOH水溶液调pH为8.0；培养基2：在液体LB培养基中加入缓冲试剂caps、缓冲试剂ches和缓冲试剂tricane(使三种缓冲试剂的浓度均为50mM)，再用10Mxa0NaOH水溶液调pH为8.5；培养基3：在液体LB培养基中加入缓冲试剂caps、缓冲试剂ches和缓冲试剂tricane(使三种缓冲试剂的浓度均为50mM)，再用10Mxa0NaOH水溶液调pH为9.0；培养基4：在液体LB培养基中加入缓冲试剂caps、缓冲试剂ches和缓冲试剂tricane(使三种缓冲试剂的浓度均为50mM)，再用10Mxa0NaOH水溶液调pH为9.5。结果见图2A。对其中pH9.0的培养基，每隔2小时测定600nm处的吸光值，结果见图2B。结果表明：在3种碱性pH值(8.0、8.5和9.0)下，重组大肠杆菌和大肠杆菌K12的生长情况近似，远远好于对照大肠杆菌和大肠杆菌缺失体Knabc，对照大肠杆菌和大肠杆菌缺失体Knabc生长情况近似。3、耐盐性检测取5ml大肠杆菌菌液接种于不同的培养基中，37℃振荡培养12小时，测定600nm处的吸光值。分别采用以下几种培养基：培养基1：液体LB培养基；培养基2：在液体LB培养基中加入NaCl，使其浓度为2g/100mL。培养基3：在液体LB培养基中加入NaCl，使其浓度为4g/100mL。培养基4：在液体LB培养基中加入NaCl，使其浓度为6g/100mL。结果见图2C。对其中采用培养基4的反应体系，每隔2小时测定600nm处的吸光值，结果见图2D。结果表明：在加入NaCl的情况下，重组大肠杆菌和大肠杆菌K12的生长情况近似，远远好于对照大肠杆菌和大肠杆菌缺失体Knabc，对照大肠杆菌和大肠杆菌缺失体Knabc生长情况近似。上述结果表明，转基因大肠杆菌可以互补被敲除掉三个Na⁺/H⁺转运蛋白基因的大肠杆菌缺失体Knabc(既不耐盐，也不耐碱)，由此推测，IMSAL1具有Na⁺/H⁺转运蛋白的功能。实施例5、转基因植物的获得和鉴定一、转基因植物的获得和鉴定分别用实施例2构建的重组质粒pPZP-IMSAL1和重组质粒pPZP-UIMSAL1制备转基因植株，方法如下：1、重组农杆菌的获得用重组质粒转化农杆菌LBA4404(鼎国MCC026)，得到重组农杆菌；将重组农杆菌单菌落接种到5m1LB培养基中28℃培养至OD600＝0.8左右(36-48小时)，即为重组农杆菌菌液。2、转基因烟草的获得采用重组农杆菌液，通过叶盘转化法(Horschxa0R.，Fryxa0J.，Hoffmannxa0N.，Eichholtzxa0D.，Rogersxa0S.，Fraleyxa0R.(1985)Axa0simplexa0andxa0genaralxa0methodxa0forxa0transferringxa0genesxa0intoxa0plants.Sciencexa0N.Y.227，1129-1136)将质粒导入烟草，得到T1代种子。T1代种子收获后在MS培养基(含有100mg/L卡那霉素)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，自交并收获T2代种子。将T2代种子培育为植株(T2代植株)。采用重组质粒pPZP-IMSAL1制备的T1代和T2代植株中，PCR鉴定为阳性的即为转IMSAL1基因植株，其中T2代植株PCR鉴定均为阳性的T1代植株为纯合的转IMSAL1基因植株，共得到3个纯合的转IMSAL1基因株系(IMSAL1-3株系、IMSAL1-6株系和IMSAL1-12株系)。PCR鉴定的方法如下：提取叶片总RNA并反转录为cDNA，用F1和R1组成的引物对对cDNA进行PCR鉴定，显示570bp左右扩增产物的植株为PCR鉴定阳性植株。采用重组质粒pPZP-UIMSAL1制备的T1代和T2代植株中，PCR鉴定为阳性的即为转UIMSAL1基因植株，其中T2代植株PCR鉴定均为阳性的T1代植株为纯合的转UIMSAL1基因植株，共得到3个纯合的转UIMSAL1基因株系(UIMSAL1-2株系、UIMSAL1-8株系和UIMSAL1-28株系)。PCR鉴定的方法如下：提取叶片总RNA并反转录为cDNA，用F2和R2组成的引物对对cDNA进行PCR鉴定，显示570bp左右扩增产物的植株为PCR鉴定阳性植株。采用载体pPZP-GFP代替重组质粒进行步骤1和步骤2的实验，得到转空载体植株，作为转基因植株的对照。二、耐盐能力鉴定分别将六个转基因植株株系(IMSAL1-3、IMSAL1-6、IMSAL1-12、UIMSAL1-2、UIMSAL1-8和UIMSAL1-28)、1个转空载体对照株系(DZ-1)的T3代种子(每个株系50粒)和野生型烟草SR1(50粒)进行如下耐盐能力鉴定：将种子播种在MS培养基平板上；萌发7天后将幼苗等分为两组并拍照(胁迫前)，第一组继续在MS培养基平板上培养，第二组转移到含有300mMxa0NaCl的MS培养基平板上胁迫处理，28天后观察拍照(胁迫后)并检测叶绿素含量。照片如图3所示。可以观察到：胁迫前各个株系的幼苗的生长情况一致；胁迫28天后，转空载体对照株系和野生型烟草中绝大部分植株都萎蔫变黄，三个转IMSAL1基因株系植株的生长情况(50％以上的植株保持绿色)显著优于转空载体对照株系和野生型烟草，三个转UIMSAL1基因株系的生长情况(90％以上的植株均保持绿色)最好。叶绿素含量的检测方法：将幼苗称重(以g计)后放入50mL离心管中，加入20mL无水乙醇，室温浸泡24小时，得到乙醇浸提液(含叶绿素)，用紫外分光光度计分别测量乙醇浸提液在波长663nm、646nm处的光吸收值(即D₆₆₃和D₆₄₆)，采用如下公式计算叶绿素含量(Chla+Chlb)：Chla(单位为mg)＝12.21D₆₆₃-2.81D₆₄₆；Chlb(单位为mg)＝20.13D₆₄₆-5.03D₆₆₃。计算每g幼苗中含有的叶绿含量(以mg计)。结果见图4。与表型一致，胁迫28天后，野生型烟草中的叶绿素含量最低，三个转IMSAL1基因株系植株的叶绿色含量居中，三个转UIMSAL1基因株系的叶绿色含量最高。三、耐氧化胁迫能力鉴定分别将三个转基因植株株系(UIMSAL1-2、UIMSAL1-8和UIMSAL1-28)、1个转空载体对照株系(DZ-1)的T3代种子(每个株系50粒)和野生型烟草SR1(50粒)进行如下耐氧化胁迫能力鉴定：1、将种子播种在MS培养基平板上，萌发7天后转移到含有10μM甲基紫晶的MS培养基平板上胁迫处理7天再移至MS培养基平板上恢复10天；观察拍照，如图5所示。野生型烟草的生长受到严重抑制。转空载体对照株系和野生型烟草的表型一致。三个转UIMSAL1基因株系的生长情况显著优于野生型烟草。2、将种子播种在MS培养基平板上培养至萌发，将萌发7天的幼苗转入蛭石中培养两周，然用50μM氧化剂甲基紫晶(MV)喷洒叶面，放至48小时后观察并照相，如图6所示。转空载体对照株系和野生型烟草的表型一致。另外两个转UIMSAL1基因株系的生长情况与UIMSAL1-28株系一致。氧化剂甲基紫晶对UIMSAL1-28株系植株叶片伤害的程度显著轻于氧化剂甲基紫晶对野生型烟草叶片伤害的程度。四、生长周期变化分别将三个转基因植株株系(UIMSAL1-2株系、UIMSAL1-8株系和UIMSAL1-28株系)、1个转空载体对照株系(DZ-1)的T3代种子(每个株系50粒)和野生型烟草SR1(50粒)进行如下生长周期鉴定：将种子播种在MS培养基平板上，幼苗萌发10天后移栽至蛭石中，在蛭石中培养55天后的照片见图7。UIMSAL1-28株系和UIMSAL1-2株系已经开花、UIMSAL1-8株系虽未开花、但从植株大小形态观察即将开花，野生型烟草SR1和转空载体对照株系的植株还比较幼小、距离开花还较远。统计各个株系植株从萌发至开花所用的时间，取平均值。UIMSAL1-2株系、UIMSAL1-8株系和UIMSAL1-28株系的花期分别为65天左右、70天左右和60天左右，转空载体对照株系的花期为80天左右，野生型烟草的花期为80天左右。结果表明，转基因烟草的开花时间可以提前15天左右。五、Real-timexa0PCR分析分别将三个转基因植株株系(UIMSAL1-2株系、UIMSAL1-8株系和UIMSAL1-28株系)的T3代种子和野生型烟草SR1进行如下Real-timexa0PCR鉴定(检测植株耐逆性相关基因的表达)：采用博迈德公司的EASYspin植物RNA快速提取试剂盒，提取植株的总RNA，经反转录[SuperscriptTMxa0IIIxa0RNasexa0H-Reversexa0Trancriptase(Invixa0trogen，USA)withxa0oligo(dT)primer]得到cDNA，作为实时荧光定量PCR的模板。利用ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="134"/>Green染料(TOYOBO公司产品)法，在DNAxa0enginexa0Opticon2PCR仪(MJxa0Reseachxa0Incorporated)中进行反应，反应体系为：1μLxa0cDNA，7.5μLntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="134"/>Greenxa0Realtimexa0PCRxa0Masterxa0Mix，引物1和2各0.25μL，补ddH20到15μL。设定反应条件为：94℃预变性3min，94℃xa030s，60℃xa030s，72℃xa030s，共进行40个循环，最后72℃延伸10min。通过比较Ct的方法进行基因表达水平的定量分析，实验进行3次生物学重复和3次技术重复。Nthis基因作为内参基因。NtKC1、TORK1、POT1为K⁺通道相关基因；CaBI为钙结合蛋白离子通道相关基因；ACO、ACS为乙烯合成酶相关基因。检测NThis基因的引物序列如下：Nthis-F：5’-TCCxa0TGGxa0GCAxa0ATTxa0TCAxa0CGAxa0ACAxa0AGC-3’；Nthis-R：5’-TGCxa0CCGxa0TAAxa0ATCxa0TACxa0TGGxa0AGGxa0CAA-3’。检测NtKC1基因的引物序列如下：NtKC1-F：5’-TCCAGCGGTGAAATACGA-3’；NtKC1-R：5’-GTCAACCACTAAATCAACAGGC-3’。检测TORK1基因的引物序列如下：TORK1-F：5’-ATGGCAACTGTGGGTTACG-3’；TORK1-R：5’-CTCCCGAGTCTATTTCTGTTCA-3’。检测POT1基因的引物序列如下：POT1-F：5’-GCCTTTATTACATCTGCCACC-3’；POT1-R：5’-CTCCGTTTACTTTCTTTCCCTC-3’。检测CaBI基因的引物序列如下：CaBI-F：5’-ATCAGCATTCCACACGGA-3’；CaBI-R：5’-GAAACCTCACAAACTCGTCTTG-3’。检测ACO基因的引物序列如下：ACO-F：5’-GAGAAAGAGGCAGCGGAGAG-3’；ACO-R：5’-ACCAAAACAAGCAAATAATG-3’。检测ACS基因的引物序列如下：ACS-F：5’-AATCGCATAGTTATGAGTGG-3’；ACS-R：5’-TCAAGAAGAGTGCCTAGTGG-3’。结果图8和图9。Real-timexa0PCR分析结果表明，在转基因植物中多个离子通道蛋白基因的表达受到了诱导，并且与乙烯合成相关的基因表达量有所提高，这与转基因烟草生长周期缩短相吻合。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="428"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="500"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="597"/>